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斑马鱼产品
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基本信息-
产品名称Annexin V-Alexa Fluor647/PI 细胞凋亡检测试剂盒
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保存温度2-8℃ 避光 勿冷冻
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有效期1年
产品简介细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内转移到细胞膜外，使 PS 暴露在细胞膜外表面。PS 是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS 暴露在细胞膜外。Annexin V 具有易于结合到磷脂类如 PS 的特性，对 PS 有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的 PS。PS 转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此，可以采用 AnnexinV 与PI 双染的方法，通过流式检测细胞早期凋亡。
产品组成| 组分 | 20T | 50T |
| Annexin V-Alexa Fluor 647 | 100μl | 250μl |
| Propidium iodide(PI)(20μg/ml) | 100μl | 250μl |
| Binding Buffer（10×） | 2ml | 5ml |
操作步骤（仅供参考）操作步骤（仅供参考）
1. 细胞样品的准备：
a)对于贴壁细胞：小心收集细胞培养液到一离心管内备用。用不含EDTA的胰酶消化细胞，至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。1000rpm 左右离心5min，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞无法完全离心至离心管底，可以适当延长离心时间或稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约 50μl 左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约1ml 4°C预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。
b)对于悬浮细胞：1000rpm 左右离心 5min，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞无法完全离心至离心管底，可以适当延长离心时间或稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约50μl 左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约 1ml 4°C 预冷的 PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。
2. 用去离子水按 1:9 稀释结合缓冲液（2 ml 10×结合缓冲液+18ml 去离子水）。
3. 用 1×结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度为 1-5×106/ml。
4. 取 100μl 的细胞悬液于 5ml 流式管中，加入 5μl Annexin V-Alexa Fluor 647 混匀后于室温避光孵育 5 分钟。
5. 加入 5μl 20μg/ml 的碘化丙啶溶液（PI），并加 400μlPBS，立刻进行流式检测。
实验设计
1)未转染细胞
空白管：阴性对照组细胞，不加 Annexin V-Alexa Fluor647，碘化丙啶溶液（PI）。用于调节电压。
检测管：处理的细胞，加 Annexin V-Alexa Fluor 647，碘化丙啶溶液（PI）。用空白管和单染管调节好电压补偿后，获得所需要的流式数据。
注：无需单染管 Annexin V-Alexa Fluor 647 调补偿。
2)转染 GFP 细胞
未转染空白管：未转染细胞，不加 Annexin V-Alexa Fluor647，碘化丙啶溶液（PI）。用于调电压。
转染 GFP 空白管：转染 GFP 对照组细胞，不加 Annexin V-Alexa Fluor 647，碘化丙啶溶液（PI）。用于调补偿。
检测管：处理的细胞，加 Annexin V-Alexa Fluor 647，碘化丙啶溶液（PI）。调节好电压补偿后，获得所需要的流式数据。
实验参考图
Jurkat 细胞用顺铂诱导凋亡后用 Annexin V-Alexa Fluor 647/PI 双染流式分析图谱
常见问题1. Annexin V/PI 凋亡检测的试剂盒能否检测人以外其他动物的细胞凋亡情况？
可以，因为 Annexin V 是与磷酯酰丝氨酸（PS）亲和，而 PS 在不同种属间没差异。在正常细胞中，PS 只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，PS 由脂膜内侧翻向外侧。
2. 贴壁细胞做凋亡用胰酶消化下来对细胞膜损伤？
低浓度胰酶消化，轻柔吹打贴壁细胞 2-3 次，离心机 4°C 1000rpm 左右离心5min ，处理得当的话，胰酶造成的损伤可以控制在 5%以内，有对照组的情况下对实验结果不会造成明显影响。
3. 为什么只能用不含 EDTA 的胰酶消化细胞，用含 EDTA 的胰酶消化细胞对结果有什么影响？
因为 Annexin V 是钙依赖的蛋白，所以不能加入 EDTA，防止EDTA 螯合钙离子从而影响AnnexinV ，进而影响结果。
4. 贴壁细胞可以先染 PI 然后再消化下来吗？这样是否可以减小由于消化液造成的细胞膜破损而染上的 PI 的误差？
先加 PI 不仅染色是否每组都均匀充分很难判断，而且 PI 本身对细胞也是有毒性的，对实验结果影响会比胰酶大，不建议这样做。
5. 有些厂家说明书 Annexin V 和 PI 一起加？为什么你们先加 Annexin V 后加PI?
用流式检测凋亡时，PI 受时间的影响很大，因标记了 PI 后会加大细胞毒性，随着时间延长会导致PI 的染色增加，特别是检测早期凋亡时，如果时间延长除了会导致在流式细胞仪上的细胞分群差距加大外，误差会明显加大。一般 PI 加上后立刻上机，然后在一个小时内检测完成。两种方法都可以，但是按照我们的操作步骤造成的误差会更小。
注意事项1. 我司生产的生化试剂如无特殊标注，基本为非无菌包装，若用于细胞实验，请提前做好预处理。需低温保存的产品，一旦配成溶液，请分装保存，避免反复冻融造成的产品失效。
2. 本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床诊断或治疗，食品及化妆品等用途。请勿存放于普通住宅区。
3. 为了您的安全和健康，请穿好实验服并佩戴一次性手套和口罩操作。
4. 实验结果可由多种因素影响，相关处理只限于产品本身，不涉及其他赔偿。
备注：由于产品信息可能会有优化升级。请以实际收货标签信息为准。
