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斑马鱼产品
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基本信息-
产品名称快速DNA直扩试剂盒
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保存温度-20℃
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有效期2年
产品简介■ 本试剂盒包含快速组织裂解及扩增试剂, 样本预处理试剂用于从鼠尾、 组织、 叶片、 种子等多种样本中快速释放基因组DNA并直接用于普通PCR扩增, 具有较强的样本兼容性。
■ 本产品无需进行复杂的DNA抽提步骤, 各种动植物组织样本只需经过简单的裂解即可作为PCR扩增模板。2×Direct Amplification Mix(Dye)是由高效热启动DNA Polymerase、独特的延伸因子、dNTPS以及高性能稳定剂和增强剂组成的预混体系,扩增速度可达1 - 10 s/kb, PCR反应体系中只需加入引物和模板即可直接进行扩增, 降低了试剂、 模板等的交叉污染概率, 提高结果的可重复性。
■ 2×Direct Amplification Mix (Dye)中含有电泳指示剂, PCR反应结束后可直接进行琼脂糖凝胶电泳, 方便操作。 本试剂盒适用于小鼠转基因检测、 小鼠基因分型、 动植物直扩、 血液直扩、 菌落直扩等。
产品特点简便：无需复杂的样品处理步骤。
高抗逆：无需高纯度的核酸模板。
省样本：取2mm左右直径大小的组织即可。
安全：远离酚、氯仿等有毒物质，远离液氮研磨等危险操作。
低成本：无需额外购买基因组DNA提取试剂盒
产品组成| 产品组分 | 80rxns | 400rxns |
| DNA Extract solution A | 5ml | 25ml |
| DNA Extract solution B | 5ml | 25ml |
| 2X Direct Amplification Mix（Dye） | 1ml | 5x1ml |
操作步骤（仅供参考）一、样本预处理
1. 根据不同的样本类型, 按照下表准备相应的样本用量。
2. 将样本加入到PCR管或1.5 mL离心管中, 加入下表推荐体积的 solution A, 混匀震荡20 s ,使样本完全处于液面以下, 并按照下表推荐的处理方法, 放置于PCR仪中加热处理或金属浴中振荡孵育。
3. 样本充分裂解后, 加入下表推荐体积的 solution B, 并涡旋震荡30 s。
4. 处理后的样本如不能立即进行下一步试验, 可在4℃存放2小时。
| 样本类型 | 样本用量 | solution A | 处理温度及时间 | solution B |
| 小鼠组织 | 鼠尾长度1-3 mm 鼠耳直径1-3 mm | 50ul | 95℃ 5-10 min | 50ul |
| 植物叶片、 嫩芽 | 直径2-5 mm | 50ul | 95℃ 5-10 min | 50ul |
种子 | 直径2-3 mm/重量2-5 mg | 50ul | 95℃ 5-10 min | 50ul |
石蜡切片 | 直径10um大小，2-3张 | 200ul | 95℃ 5-10 min | 200ul |
注意：
根据实验条件需求, 可以扩大或减小样本用量, 并等比例增加solution A及solution B用量。有的样本 (如血液、血片、动物细胞和唾液等) 不需裂解处理, 可直接进行扩增。每个反应 (25ul体系) 用量控制在血液<2ul、 血片直径<2 mm, 动物细胞<2000个, 睡液<2ul, 如需加入更大用量, 建议先按照上述操作进行裂解后再扩增。
二、PCR扩增
以下举例为常规PCR反应体系和反应条件, 实际操作中应根据模板、 引物结构和目的片段大小不同进行相应的改进和优化; 组分解冻后请充分混匀, 用完之后请及时放回-20℃或4℃保存 。
1. PCR反应体系
| 组分 | 25ul反应体系 | 终浓度 |
| 2X Direct Amplification Mix（Dye） | 12.5ul | 1x |
| Forward primer，10uM | 0.5-1ul | 0.2-0.4uM |
| Reverse primer，10uM | 0.5-1ul | 0.2-0.4uM |
| Template DNA | 1-2ul | 适量 |
| ddH2O | up to 25ul | / |
注意: 可等比例放大或缩小反应体系, 引物浓度请以终浓度0.2-0.4uM作为设定范围的参考。
2. PCR反应程序
| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
| 预变性 | 98℃ | 30s-3min① | 1 |
| 变性 | 98℃ | 10s | 3-50个循环④ |
| 退火 | 根据引物Tm定② | 30s | |
| 延伸 | 72℃ | 10s/kb③ | |
| 终延伸 | 72℃ | 3-5min | 1 |
| 保存 | 4-12℃ | ∞ |
注意:
①预变性: 质粒DNA、入DNA、简单基因组DNA等模板的预变性时间可设置为30s-1min,对于粗样品、 高GC、人基因组等复杂的模板, 预变性时间可延长至3min。
②退火: 2×Direct Amplification Mix (Dye)中含有较高离子浓度, 反应退火温度可设置高于理论引物Tm值2-3℃, 如无法得到理想的扩增效率时, 可梯度改变退火温度, 进行优化; 发生非特异性反应时, 适当提高退火温度。
③延伸: 根据其目的片段长度设置延伸时间 , 简单裂解模板及短片段可设置1 - 5s/kb , 对于复杂裂解模板及≥1k片段设置10s/kb延伸 。
④循环数: 可根据扩增产物的下游应用设定循环数, 如果循环次数太少, 扩增量不足, 循环次数太多, 错配机率会增加, 所以在保证产物得率的前提下应尽量减少循环次数。
三、结果检测
反应结束后取5ul反应产物, 直接进行琼脂糖凝胶电泳检测。
注意事项1. 本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床诊断或治疗，食品及化妆品等用途。请勿存放于普通住宅区。
2. 为了您的安全和健康，请穿好实验服并佩戴一次性手套和口罩操作。
3. 实验结果可由多种因素影响，相关处理只限于产品本身，不涉及其他赔偿。
备注：由于产品信息可能会有优化升级，请以实际收货标签信息为准。
常见问题1. 无扩增产物或扩增产物浓度低
a 可适当提高引物浓度
b 设置梯度退火, 找到合适退火温度
c 适当增加延伸时间或增加PCR循环数
d 调整模板使用量或重新裂解。
2. 非特异较多或条带弥散
a 尝试提高退火温度
b 适当降低引物浓度
c 减少循环数
d 调整模板使用量
e 优化引物设计
