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Faustovirus加帽酶(不含DNA内切酶和外切酶,不含RNA酶,不含磷酸酯酶)  Cite:0    分享
Faustovirus Capping Enzyme

货号： S51357
复制产品信息
  • 用途：体内或体外翻译前mRNA的加帽；mRNA的5'末端标记
规格:
500U 2500U
单位:
支
单价:￥550.00
产品简介
产品简介
产品组成
操作步骤（仅供参考）
注意事项
产品简介
  • 中文名称
    Faustovirus加帽酶
  • 英文名称
    Faustovirus Capping Enzyme
  • 来源
    由大肠杆菌表达Faustovirus Capping Enzyme基因，经纯化而获得
  • 活性定义
    One unit of Faustovirus Capping Enzyme is defined as the amount of enzyme required to convert75pmol of a 20-mer transcript to Cap-0 RNA in 30 minutes at 37ºC
  • 纯度
    不含DNA内切酶和外切酶，不含RNA酶，不含磷酸酯酶
  • 酶储存溶液
    40mM Tris-HCl (pH8.0 @ 25ºC), 100mM NaCl, 50mM Arginine, 0.1mM TCEP, 50% Glycerol
  • Capping Buffer (10X)
    500mM Tris-HCl (pH8.0 @ 25ºC), 50mM KCl, 10mM MgCl2, 10mM DTT, 0.2% Poloxamer 188
  • 失活或抑制
    70ºC加热10分钟可使Faustovirus Capping Enzyme失活
  • 应用
    体内或体外翻译前mRNA的加帽；mRNA的5'末端标记
  • 保存温度
    -20℃
  • 有效期
    2年
产品简介

■ 本品Faustovirus Capping Enzyme (FCE)，即Faustovirus加帽酶，是一种来自Faustovirus S17菌株的单亚基mRNA加帽酶。FCE具有给mRNA添加Cap-0帽结构所需的三种酶活性，即三磷酸酶(Triphosphatase, TPase)、鸟嘌呤转移酶(Guanylyltransferase, GTase)和(鸟嘌呤-N7)-甲基转移酶((Guanine-N7)-Methyltransferase, N7 MTase)的活性，它可在真核生物mRNA的5'末端的三磷酸和二磷酸位置催化加入N7-甲基鸟苷帽结构(m7GpppNp)，从而产生带有Cap-0帽结构的mRNA 。
■ 与牛痘病毒加帽酶(Vaccinia capping enzyme, VCE)相比，FCE具有更宽的反应温度范围和更高的酶活性，且在37ºC和高至55ºC的温度下都能够具备加帽活性。FCE与mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase协同作用，可一步添加Cap-1帽结构至mRNA。真核生物mRNA Cap-0和Cap-1帽结构的添加以及poly (A)加尾对于其成熟至关重要，其中Cap-0帽结构可以通过保护mRNA免遭5'→3'核糖核酸外切酶降解以增加mRNA稳定性，还可防止三磷酸化的mRNA激活机体的天然免疫反应。

产品组成
产品组分
500U2500U
试剂A:Faustovirus Capping Enzyme (25U/μl)20μl100μl
试剂B:Capping Buffer (10X)100μl500μl
试剂C:GTP (10mM)30μl150μl
试剂D:SAM (32mM)10μl50μl


操作步骤（仅供参考）

1. FCE对mRNA添加Cap-0帽结构。
a. DNA模板的制备。带有T7 Promoter或其它适当启动子的线性化质粒DNA、PCR产物或合成的DNA片段等均可以作为体外转录的模板。
b. mRNA的制备。使用T7 RNA Polymerase和ATP (100mM, Nuclease free)、CTP (100mM,Nuclease free) 、GTP (100mM, Nuclease free) 及UTP (100mM, Nuclease free)，或T7 HighYield RNA Transcription Kit，或T7 Quick High Yield RNA Transcription Kit或其它启动子对应的酶或试剂盒转录获得mRNA。
c. SAM (2mM)的配制。在反应开始前根据实际反应数配制新鲜SAM工作液。将SAM (32mM)分装并用Ultrapure Water (DNase/RNase-Free, Sterile)稀释至2mM，放置于冰上备用。
d. 对mRNA添加Cap-0帽结构的反应体系的设置。请参考下表在冰浴中配制如下反应体系。

ReagentVolumeFinal Concentration
Ultrapure Water(37-x)μl-
mRNAxμlUp to 1μg/μl
65ºC for 5min, then immediately incubate in ice-bath0.04mM
RNase Inhibitor (40U/μl)1μl0.8U/μl
Capping Buffer (10X)5μl1X
GTP (10mM)2.5μl0.5mM
SAM (2mM)2.5μl0.1mM
Faustovirus Capping Enzyme (25U/μl)2μl1U/μl
Total Volume50μl-

注意：
1. 如果只进行一个反应，请把除Faustovirus Capping Enzyme以外的组分充分混匀后，再加入Faustovirus CappingEnzyme；如果同时进行多个反应，可以把上表中除mRNA之外的所有溶液和酶提前预混合后分装到各反应管内，再加入65ºC变性5分钟后立即置于冰浴中的mRNA，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀，或用Vortex在最低速度轻轻混匀)后低速离心沉淀液体。
2. 本反应体系中涉及RNA，可以酌情适量添加RNase Inhibitor, Murine 、RNase Inhibitor、RNaseInhibitor Plus, Human Placenta 或RNase Inhibitor, Human Placenta 。
3. 在与FCE温育前，将mRNA溶液在65ºC加热5分钟以打开转录产物5'末端的二级结构。对于5'末端高度结构化的转录产物，可将时间延长至10分钟或适当提高变性温度。
4. SAM在pH值为7-8，37ºC条件下不稳定，建议在反应开始前再配制新鲜的工作液并将其放置于冰上，防止SAM降解。
5. 对于5'末端结构化的转录产物，可将反应时间适当延长以提高加帽效率。
6. 标记5'末端时，GTP总浓度应为反应中mRNA摩尔浓度的1-3倍。可以将10mM GTP酌情稀释并掺入一定量的经荧光探针、生物素等标记的GTP以制成GTP混合物。
7. FCE也可与mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase协同作用，可一步添加Cap-1帽结构至mRNA。
e. 反应条件：37ºC孵育60分钟。对于长度小于200nt的RNA，宜将孵育时间延长至2小时或减少底物的用量。
f. 终止反应：70ºC加热10分钟可使Faustovirus Capping Enzyme失活。
g. 反应后可通过质谱(Mass spectrometry, MS)分析或者细胞转染(Transfection)进一步检测加帽效率。
2. 其它应用请参考相关文献资料进行。

注意事项

1. 本产品使用时宜放在冰盒内或冰浴上，使用完毕后宜立即放置于-20ºC保存。
2. 由于涉及RNA操作，须严格按照RNA操作的规范进行，避免RNase污染。
3. 实验中用到的吸头、离心管等实验耗材必须为RNase free的或须经DEPC处理。
4. 可根据具体应用选择合适的操作方法，可能需准备额外的试剂，如RNase Inhibitor、超纯水等。
5. SAM在pH值为7-8，37ºC条件下不稳定，建议在反应开始前根据实际反应数配制新鲜的工作液并放置于冰上，防止SAM降解。

6. 我司生产的生化试剂如无特殊标注，基本为非无菌包装，若用于细胞实验，请提前做好预处理。需低温保存的产品，一旦配成溶液，请分装保存，避免反复冻融造成的产品失效。
7. 本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床诊断或治疗，食品及化妆品等用途。请勿存放于普通住宅区。

8. 为了您的安全和健康，请穿好实验服并佩戴一次性手套和口罩操作。

9. 实验结果可由多种因素影响，相关处理只限于产品本身，不涉及其他赔偿。

 

备注：由于产品信息可能会有优化升级。请以实际收货标签信息为准。

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