本品活细菌/死细菌染色试剂盒是采用CYTO 9/PI绿色-红色荧 光探针双染细菌的方法染色活细菌和死细菌。
细菌细胞活性取决于其代谢特征或膜完整性。但是依赖于代谢特征的检测方法通常只适用于部分细胞类型。评估细胞膜完整性的方法具有更高的灵敏度和更普遍的适用性。 本品活细菌/死细菌染色试剂盒利用细菌细胞膜的完整性差异，可以可靠地进行染色并在几分钟内定量区分活细菌和死细菌。
本试剂盒中的CYTO 9活细菌染色探针为绿色荧光标记的活细菌探针，能透过活细菌的完整结构的质膜，具有480 / 500 nm的最大激发/发射波长。膜受损的死细菌染色探针为PI，是一种红色荧光核酸染色剂，只能穿透膜受损的死细菌。具有完整细胞膜的细菌将 被荧光染料染成明亮的绿色，而膜受损的细菌表现出较少的绿色荧光，会发出较强的红色荧光。当膜通透性的绿色荧光探针CYTO 9进入细菌后，跟细菌的核酸结合。染色探针CYTO 9在 进入细胞膜之前荧光较弱，当与活细菌的DNA结合后其荧光强度大大增强，被激发后可以 发出绿色的荧光，具有很高的淬灭常数和激发态寿命。单独使用CYTO 9染料时可以染色所有细菌，包括膜结构完整的细菌和膜受损的细菌。红色核染色染PI不能穿过活细菌的完整细胞膜，它仅穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞，并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光(激发：488，545nm，发射：635 nm)，因此PI仅对膜受损的死细胞染色。根据以上特点，CYTO 9和PI可以被结合用来作为活细菌和死细菌的双重染色。由于CYTO 9和PI-DNA都可被488 nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。
本试剂盒是利用活死细菌的膜通透性改变进行的检测，适用于荧光显微镜和流式细胞仪。本测定原理适用于大多数细菌类型，包括各种革兰氏阳性和革兰氏阴性菌。细菌活力的常见标 准是细菌在合适的营养培养基中繁殖的能力生长测定，使用本试剂盒产生的结果与液体或固 体培养基中的生长检测相关性良好。但是需要注意，不同于动物细胞，在一定的条件下，具有损伤膜的细菌可能能够恢复和繁殖，这种细菌可以在本试剂盒的测定中被检测为“死亡”。相反，一些膜完整的细菌可能无法在营养培养基中繁殖，然而这些细菌可能被记为在 这个测定中被检测为“活着”。如果在该测定法和细菌之间观察到相当大的差异，应该考虑 这些可能性。
以每个样本100 μl染色液计，本试剂盒小包装可以染色500个样本。
荧光探针CYTO 9除了最简单的细菌核荧光标记外，还可以用于荧光成像，微孔板分析和流式细胞术。在合适的滤光器下，这种DNA结合染料与其他颜色的荧光染料一起可用于活细 菌的多种颜色分析。

1. 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
2. 染色液A为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。融解后离心至管底部 再打开螺旋盖。
3. 试剂A为了便于观察防止误操作导致损失，在试剂盒中时是采用透明管包装，收到后可以离心移入干燥黑色避光密封管或者用铝箔包裹避光。
4. 建议收到产品后，根据单次使用量，对DMAO母液进行小量分装，每次使用一管，试剂-20℃避光冻存，一年稳定。
5. 细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。
6. 所有染色操作在塑料容器进行，不要在玻璃容器染色。
7. 以下为进行活死细菌染色观察的参考步骤，可以根据文献的方法进行调整。如果有必要，也可以设定对照活细菌和死细菌，进行定量检测。可以参考附录中的对照细胞设定方法，也可以根据需要自己设定 对照和检测方法。
8. 标记的条件因细菌种类而异，根据不同样本的实际染色结果做相应调整，在每次实验前，请先根据不同的实验要求、细菌类型、细菌的膜通透性等进行优化，确定最佳条件。以下方法仅供参考。
9. 流式检测时建议添加直径6.0 µm微球标准品。
10. 细菌类型会明显影响红色荧光的量。
关于细菌死/活的定义标准
11. 需要注意任何单一指标判断细菌死活的局限性。就单个细菌样本的生理状态而言，并不容易定义生存能力或形态参数，因此进行单个指标的生存力测定可能会在实验中引入特定的偏见。
12. 本试剂盒的这种LIVE /DEAD细菌膜通透性染色测定与在合适的液体或固体营养培养基中进行生 长分析的其它细菌生存力的标准一般需要结合分析。 在某些情况下，细菌膜受损可能会恢复和繁殖，即使 此类细菌在本试剂盒分析中可能被评为“死亡”。相反，某些具有完整膜的细菌可能无法在营养培养基中繁殖，但在本试剂盒分析中被评为“活”。
13. 几种不同的生存能力衡量指标，例如膜渗透性，酶活性和氧化还原电位需要综合分析评判，才可能提供更多彻底评估细菌生存力并消除固有的任何单一生存力测定法的局限性。
关于染色条件的优化
14. 不同的细菌类型会明显影响荧光的量。
15. 建议的染色条件染色以下细菌类型显示出良好的相关性，其它细菌类型请在以下范围或超过以下浓度范围内测试最佳染色条件：Bacillus cereus, B. subtilis, Clostridium perfringens, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Micrococcus luteus, Mycobacterium phlei, Pseudomonas aeruginosa, P. syringae, Salmonella oranienburg, Serratia marcescens, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus，Streptococcus pyogenes，Agrobacterium tumefaciens, Edwardsiella ictaluri, Eurioplasma eurilytica, Lactobacillus sp., Mycoplasma hominus, Propionibacterium sp.,Proteus mirabilis and Zymomonas sp.。
16. 标记的条件因细菌种类而异，根据不同样本的实际染色结果做相应调整，在每次实验前，请先根据不同的实验要求、细菌类型、细菌的膜通透性等进行优化，确定最佳条件。
自备材料
荧光酶标仪/荧光光度计/激光共聚焦/流式细胞仪/荧光显微镜等，离心机，移液器，冰箱，冰盒，0.85% NaCl溶液，离心管，吸头，一次性手套
染色工作液的配制
根据样品数按下列比例配制染色工作液。 用37℃培养箱预热0.85% NaCl溶液将CYTO 9荧光染料进行500倍稀释，将PI进行100-500 倍稀释，配制成染色工作液。
 例如：
每10ml 0.85% NaCl溶液中加入20 μl染色液A，充分混匀，即成染色工作液A。
每10ml 0.85% NaCl溶液中加入20-100 μl染色液B，充分混匀，即成染色工作液B。
细菌染色
1. 收集样本细菌，用0.85% NaCl溶液洗涤细胞3次。
2. 用100 μl-200 μl 染色工作液将细菌重悬。
3. 在室温避光孵育15分钟。
4. 用0.85% NaCl溶液洗涤细菌一次。
5. 用适量0.85% NaCl溶液重悬细菌。
6. 将5 μl菌液滴加到载玻片，盖上盖玻片，油镜观察。
7. 用荧光显微镜观察。激发波长为488 nm，最大发射波长为500 nm和635 nm。
结果分析
可以在Ex / Em = 488 / 500 nm（FITC滤光器组）和540 / 635 nm（TRITC滤光器组）下荧光测量染色细胞， 分别用于活细菌和死细菌。
荧光显微镜下，使用490±10nm波长激发，活细菌为黄绿色，死细菌为红色。 用545 nm波长激发，仅能够看到红色的死细菌

1. 正式实验前请选取几个样本做预实验，以优化实验条件，取得最佳实验效果。
2. 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管底， 避免开盖时试剂损失。
3. 样品或试剂被细菌或真菌污染或试剂交叉污染可能会导致错误的结果
4. 最好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清洗 并彻底清除残留清洁剂。
5. 实验后完成后所有样品及接触过的器皿应按照规定程序处理。

6. 我司生产的生化试剂如无特殊标注，基本为非无菌包装，若用于细胞实验，请提前做好预处理。需低温保存的产品，一旦配成溶液，请分装保存，避免反复冻融造成的产品失效。
7. 本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床诊断或治疗，食品及化妆品等用途。请勿存放于普通住宅区。

8. 为了您的安全和健康，请穿好实验服并佩戴一次性手套和口罩操作。

9. 实验结果可由多种因素影响，相关处理只限于产品本身，不涉及其他赔偿。

备注：由于产品信息可能会有优化升级。请以实际收货标签信息为准。