细胞发生凋亡时, 会激活一些 DNA 内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA，产生180bp-200bp 的 DNA 片段，表现为琼脂糖凝胶电泳中呈现的特异的梯状 Ladder 图谱。基因组DNA双链或单链断裂时会出现产生大量的粘性 3'-OH 末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的催化作用下，与生物素（Biotin）-dUTP 结合，从而通过光学显微镜直接进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（Terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick endlabeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有 DNA 的断裂，因而没有3'-OH 形成，很少能够被染色。TUNEL 法可以对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中广泛采用。
本试剂盒应用范围广，可用于检测冷冻或石蜡切片中的细胞凋亡情况，也可检测培养的贴壁细胞或悬浮细胞的凋亡情况。可选择性的检测凋亡细胞，而非坏死细胞或因辐照和药物治疗而造成的DNA链断裂的细胞。

自配材料
S51102-4%组织细胞固定液，蒸馏水，石蜡切片处理相关试剂；1×PBS 缓冲液（pH7.2-7.4），0.2% Triton X-100（PBS 配制）， 0.3%H2O2（PBS 新鲜配制）或其他内源性过氧化物酶封闭液；免疫组化笔，中性树胶。
实验设计
A. 阳性对照（可选）: DNase I 处理制备阳性对照载玻片。DNase I 可以消化单链或双链DNA产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶，人为造成细胞凋亡。
B. 阴性对照（可选）: 使用不含 TdT 酶的 Biotin-dutp 标记液，用蒸馏水替代TdT 酶。
C. 实验处理组
D. 实验对照组
操作步骤(仅供参考)
1. 样本准备：
（1）对于贴壁细胞或细胞涂片
a. PBS 清洗 1 次。(注：如果担心细胞涂片的细胞贴得不牢，可以干燥样品使细胞贴得更牢)
b. 固定：加入适量 4%组织细胞固定液，室温固定 30min。PBS 清洗 2 次。
c. 通透：加入适量 0.2% Triton X-100（PBS 配制），室温通透 5-10min。PBS 清洗2 次。
d. 封闭：每孔加入 100uL 左右的内源性过氧化物酶封闭液，并使其充分覆盖细胞，室温避光封闭20-30min，以灭活细胞内源的过氧化氢酶，随后用 PBS 清洗 2 次。
e. 转步骤 2. TUNEL 反应。
（2）对于悬浮细胞或细胞悬液
a. 收集细胞（3-5×106个细胞），1000rpm 离心 5 min，PBS 清洗 2 次。
b. 固定：加入适量 4%组织细胞固定液充分重悬细胞，4℃固定 30min。2000rpm 离心5 min，PBS清洗2次。
c. 通透：加入适量 0.2% Triton X-100（PBS 配制），室温通透 5-10min。2000rpm 离心5 min，PBS清洗2次。
d. 封闭：每孔加入 100μL 左右的内源性过氧化物酶封闭液，轻轻吹吸重悬细胞，室温避光封闭20-30min，以灭活细胞内源的过氧化氢酶，随后用 PBS 清洗 2 次。
e. 转步骤 2. TUNEL 反应。
（3）石蜡组织切片
a. 脱蜡与水化：将切片样本依次放入二甲苯 I（10 min）→ 二甲苯 II（10 min）→100%乙醇I（5min）→ 100％乙醇 II（5 min）→ 95%乙醇（5 min）→ 90%乙醇（5 min）→ 80%乙醇（5 min）→70%乙醇（5 min）→ ddH2O 冲洗 5 min，冲洗 2 次。(注：二甲苯有毒，易挥发，请在通风橱中进行此操作。)
b. 用滤纸吸干切片样本周围液体，用免疫组化笔圈好样本轮廓，以便下游通透与标记。(注：若在后续实验操作中发现免疫组化笔画的轮廓圈被破坏，需及时补画。)
c. 通透：按 1: 100 的比例，将蛋白酶 K(2mg/ml)用 PBS 稀释至终浓度 20µg/mL，在每个样本上滴加50µL，使溶液覆盖全部样本区域，20-37℃孵育 20min。(注：蛋白酶 K 可通透细胞膜和核膜，从而使后续步骤的染色试剂充分进入细胞核进行反应，提高标记效率。孵育时间过长会增加组织切片在后续洗涤步骤中从载波片上脱落的风险，过短则可能造成透性处理不充分，影响标记效率。为得到更好的结果，蛋白酶K的浓度、孵育时间、温度需根据不同类型组织样本进行优化。)
d. PBS 漂洗切片 2 次，每次 5min。(注：这一步必须把 Proteinase K 洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。)
e. 封闭：加入适量 0.3%H2O2 溶液（PBS 新鲜配制），室温孵育 30min，以灭活细胞内源的过氧化氢酶。PBS 漂洗切片 2 次，每次 5min，用滤纸吸去多余的液体，将处理好的样品放在湿盒中保持湿润。
f. 转步骤 2. TUNEL 反应
（4）阳性处理（仅阳性对照进行此步骤，其他样品直接进行 TUNEL 反应步骤）
a. 用 DNase I 稀释液将 DNase I 稀释 100 倍后使用。
b. 滴加 50μL DNase I 工作液，室温孵育 10 min。
c. 弃去 DNase I 工作液，PBS 清洗 2 次。
d. 转步骤 2. TUNEL 反应。
2. TUNEL 反应：
(1) 配制生物素标记液

a.每个样品上加 50μL 生物素标记液，37℃避光孵育 60 分钟。(注意：50μL 生物素标记液适合涂片、切片或 96 孔板、48 孔板、24 孔板或 12 孔板的一个孔，如果是 6 孔板中的一个孔生物素标记液宜使用100μL。如果待检测的样品为涂片、切片或在 24 孔板、12 孔板或 6 孔板中，可以使用防蒸发膜，或自行尝试使用自封袋或者其它适当材料自行裁剪成比孔略小的圆形塑料片，滴加生物素标记液后覆盖在样品上，可以防止生物素标记液蒸发，并且使生物素标记液均匀覆盖样品。自行裁剪圆片时需要连着圆片突出一个角或连着一条，并将圆形之外的突出部分折叠，方便染色结束后利用突出部分顺利取出圆片。也可以用PAPPen圈出一个区域进行染色。孵育时需注意在多余的孔和多孔板的空隙中加入适量水以保持湿润，从而尽量减少生物素标记液的蒸发。)b. PBS 或 HBSS 洗涤 3 次。
(2) Streptavidin-HRP 工作液和 DAB 显色液的配制

                                                                                          和

(3) 样品显色
a. 每个样本加入 50μLStreptavidin-HRP 工作液，37℃孵育 30min。
注：50μL Streptavidin-HRP 工作液适合涂片、切片或 96 孔板（其他不同孔板可以适当调整Streptavidin-HRP工作液体积，覆盖细胞即可）。为防止 Streptavidin-HRP 工作液蒸发，建议在样本上覆上防蒸发膜。
b. 弃去 Streptavidin-HRP 工作液，PBS 清洗 2 次。
c. 每个样本加入 50μL DAB 显色液，室温避光孵育 1~20min 或更长时间，孵育时间根据样本显色情况而定，若无背景出现则可继续孵育至显色达到预期深浅。
d. 去除 DAB 显色液，用蒸馏水冲洗样品 3~5 次以中止显色反应。
e.（可选）加入适量苏木素染色液进行细胞核染色 2-5min。弃去染色液，PBS 清洗2 次。
f.（可选）切片封片：梯度乙醇脱水后，二甲苯透明 2 次，每次 1min，每个样本滴加50μl 中性树脂，盖上盖玻片，用镊子的钝端轻轻敲击盖玻片，去除气泡以使封片完全。
g. 用滤纸吸去多余的液体，向样本区域加入 100μL PBS 以保持样本湿润，立即在光学显微镜下分析样本。

1. 使用前请将产品瞬时离心至管底，再进行后续实验。
2. 染色背景较重或非特异性着色明显可适当减少染色时间。
3. 叠氮化钠对 HRP 有抑制作用，实验中请勿使用含有叠氮化钠的试剂。

4. 我司生产的生化试剂如无特殊标注，基本为非无菌包装，若用于细胞实验，请提前做好预处理。需低温保存的产品，一旦配成溶液，请分装保存，避免反复冻融造成的产品失效。
5. 本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床诊断或治疗，食品及化妆品等用途。请勿存放于普通住宅区。

6. 为了您的安全和健康，请穿好实验服并佩戴一次性手套和口罩操作。

7. 实验结果可由多种因素影响，相关处理只限于产品本身，不涉及其他赔偿。

备注：由于产品信息可能会有优化升级。请以实际收货标签信息为准。