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基本信息-
产品名称Annexin V-PE/7-AAD 细胞凋亡检测试剂盒
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保存温度2-8℃ 避光 勿冷冻
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有效期1年
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备注本试剂盒需使用流式细胞仪进行检测
产品简介该试剂盒检测原理是活细胞的磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)只分布在质膜磷脂双分子层的内侧。当细胞开始发生早期凋亡时，细胞膜脂质的不对称性消失，导致PS自质膜内层翻转至外层，从而暴露在细胞表面。Annexin V是一种36kDa的钙依赖性的磷脂结合蛋白，对PS有高度的亲和性。因此，荧光标记的AnnexinV可用于检测暴露于早期凋亡细胞表面的PS。
当细胞处于中晚期凋亡或发生坏死时，由于细胞膜的破裂，Annexin V可以进入细胞内部与质膜上的PS结合。因此，为了区分活细胞、早期凋亡细胞和中晚期凋亡细胞(或坏死细胞)，可通过将荧光标记Annexin V与核酸染料联合使用:活细胞和早期凋亡细胞的细胞膜仍然完整，核酸染料无法进入细胞内部与核酸结合，而中晚期凋亡(或坏死细胞)由于细胞膜的破裂，核酸染料可进入细胞内部而核酸结合，通过流式细胞术检测细胞中Annexin V和核酸染料的荧光强度，可区分活细胞(Annexin V-/核酸染料-)、早期凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-)与中晚期凋亡细胞(或坏死细胞)(Annexin V+/核酸染料+)。
注意：本试剂盒需使用流式细胞仪进行检测。
产品组成| 组分 | 20T | 50T |
| 4× (Binding Buffer 4×) | 4ml | 10ml |
| 7-AAD Viability Staining Solution | 0.2ml | 0.5ml |
| 重组人Annexin V-PE | 0.1ml | 0.25ml |
操作步骤（仅供参考）操作步骤（仅供参考）
1. 细胞样品的准备：
对于贴壁细胞：
（1）取细胞培养瓶，用移液器小心地吸取细胞培养液转移到一个干净的离心管内备用。
（2）用不含EDTA的胰蛋白酶消化细胞，至细胞可以被用移液器轻轻吹打下来时，加入收集的细胞培养液，终止消化。
（3）用移液器吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。
（4）将细胞收集到离心管内。1000rpm左右离心5min，沉淀细胞（根据待测细胞特性，可适当调整离心时间或离心力）。
（5）用移液器小心吸除上清，可保留约50µl左右的培养液，以避免吸走细胞。
（6）加入约1ml 4℃预冷的1×PBS缓冲液，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清；
对于悬浮细胞：
（1）将细胞收集到离心管内，1000rpm左右离心5min，沉淀细胞（根据待测细胞特性，可适当调整离心时间或离心力）。
（2）用移液器小心吸除上清，可保留约50µl左右的培养液，以避免吸走细胞。
（3）加入约1ml 4℃预冷的1×PBS缓冲液，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清；
2. 根据实验用量，按1:3的比例用去离子水将4×结合缓冲液稀释成1×结合缓冲液，用于后续实验。（e.g.若需要16ml 1×结合缓冲液，则取4ml 4×结合缓冲液+12ml去离子水)；
3. 用1×结合缓冲液重悬细胞，将细胞密度调节为1-5×106/ml；
4. 取100µl的细胞悬液于5ml流式管中，加入5µl Annexin V-PE用移液器轻柔吹吸混匀，室温避光孵育5分钟；
5. 加入10µl的7-AAD，并加400µl 1×PBS缓冲液，立刻进行流式检测。
注：实验过程中应注意轻柔吹吸细胞，避免造成细胞机械损伤；加入步骤5中的7-AAD和1×PBS缓冲液后，建议立即上机检测，若无法立即上机，应将细胞置于4℃条件下避光保存，并在1h内上机检测，避免长时间放置导致检测结果不准确。
实验设计
1) 未转染GFP细胞
| 流式管设置 | 待测细胞 | 样本要求 | Annexin V-PE | 7-AAD | 用途 |
| 空白管 | 100ul | 凋亡细胞+活细胞 | - | - | 流式细胞仪参数调节 |
| 7-AAD单染管 | 100ul | 凋亡细胞+活细胞 | - | 10ul | 电压及荧光补偿调节 |
| Annexin V 单染管 | 100ul | 凋亡细胞+活细胞 | 5ul | - | 电压及荧光补偿调节 |
| 检测管 | 100ul | 依据实验设计处理 | 5ul | 10ul | 正式检测 |
注：为保证仪器参数及荧光补偿的正确调节，空白管和单染管中的待测细胞应同时包括凋亡细胞和正常细胞。若无法确认待测细胞的凋亡程度，可通过热刺激诱导或凋亡诱导剂诱导凋亡后再用于空白管和单染管的检测。
2) 转染 GFP细胞
| 流式管设置 | 待测细胞 | GFP | 样本要求 | Annexin V-PE | 7-AAD | 用途 |
| 未转染GFP空白管 | 100ul | 未转染 | 凋亡细胞+活细胞 | - | - | 流式细胞仪参数调节 |
| 转染GFP空白管 | 100ul | 转染 | 凋亡细胞+活细胞 | - | - | 电压及荧光补偿调节 |
| 7-AAD单染管 | 100ul | 转染 | 凋亡细胞+活细胞 | - | 10ul | 电压及荧光补偿调节 |
| Annexin V 单染管 | 100ul | 转染 | 凋亡细胞+活细胞 | 5ul | - | 电压及荧光补偿调节 |
| 检测管 | 100ul | 转染 | 依据实验设计处理 | 5ul | 10ul | 正式检测 |
注：为保证仪器参数及荧光补偿的正确调节，空白管和单染管中的待测细胞应同时包括凋亡细胞和正常细胞，若无法确认待测细胞的凋亡程度，可通过热刺激诱导或凋亡诱导剂诱导凋亡后再用于空白管和单染管的检测。
样本分析
PE可被488nm激光激发，最大发射波长是575nm;7-AAD-DNA复合物可被488nm激光激发，最大发射波长为647nm。用FlowJo等软件进行分析，绘制双色散点图(two-color dot plot)，PE为横坐标，7-AAD为纵坐标。典型的实验中，细胞可以分成三个亚群，活细胞为PE和7-AAD双阴性群，早期凋亡细胞为PE阳性且7-AAD阴性群，晚期凋亡或坏死的细胞为PE和7-AAD双阳性群。
常见问题1. Annexin V/7-AAD凋亡检测的试剂盒能否检测人以外其他动物的细胞凋亡情况?
可以。因为AnnexinV是与磷脂酰丝氨酸(PS)亲和，而PS在不同种属间没差异。在正常细胞中，PS只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，PS由脂膜内侧翻向外侧。
2. 贴壁细胞做凋亡用胰酶消化下来对细胞膜损伤?
低浓度胰酶消化，轻柔吹打贴壁细胞2~3次，离心机4℃1000rpm离心5min，处理得当的话，胰酶造成损伤可以控制在5%以内，有对照组的情况下对实验结果不会造成明显影响。
3贴壁细胞可以先染7-AAD然后再消化下来吗?这样是否可以减小由于消化液造成的细胞膜破损而染上的7-AAD的误差?
先染7-AAD可能会导致两个问题:a.不易判断每组7-AAD是否染色均匀，b.7-AAD对细胞有毒性，对实验结果影响比胰酶消化更大。因此不建议先染7-AAD。
4. 为什么只能用不含EDTA的胰酶消化贴壁细胞，用含EDTA的胰酶消化细胞对结果有什么影响?
因为Annexin V是Ca依赖的蛋白，若加入EDTA，EDTA会螯合Ca2+离子，从而影响Annexin V与PS的结合，进而影响结果。
5. 有些厂家说明书Annexin V和7-AAD一起加?为什么你们先加Annexin V后加7-AAD?
用流式检测凋亡时，7-AAD受时间的影响很大，因标记了7-AAD后会加大细胞毒性，随着时间延长会导致7-AAD的染色增加，特别是检测早期凋亡时，如果时间延长除了会导致在流式细胞仪上的细胞分群差距加大外，误差会明显加大。一般7-AAD加上后立刻上机，在一个小时内检测完成。两种方法都可以，但是按照我们操作步骤造成的误差会更小。
注意事项1. 我司生产的生化试剂如无特殊标注，基本为非无菌包装，若用于细胞实验，请提前做好预处理。需低温保存的产品，一旦配成溶液，请分装保存，避免反复冻融造成的产品失效。
2. 本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床诊断或治疗，食品及化妆品等用途。请勿存放于普通住宅区。
3. 为了您的安全和健康，请穿好实验服并佩戴一次性手套和口罩操作。
4. 实验结果可由多种因素影响，相关处理只限于产品本身，不涉及其他赔偿。
备注：由于产品信息可能会有优化升级。请以实际收货标签信息为准。
