复合体Ⅰ（EC 1.6.5.3）又称 NADH-CoQ 还原酶或 NADH 脱氢酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，是线粒体内膜中最大的蛋白复合物。该酶催化一对电子从 NADH 传递给 CoQ，同时可使O₂还原生成 O^2-，是呼吸电子传递链上产生O^2-的主要部位。测定该酶活性，不仅可以反映呼吸电子传递链（ETC）状态，而且可以反映活性氧（ROS）生成状态。

复合体Ⅰ能够催化 NADH 脱氢生成NAD⁺，在 340nm 下测定 NADH 的氧化速率计算出该酶活性的大小。

溶液的配制：

1. 试剂二：临用前取一支加入 1 mL 丙酮，充分溶解，2-8℃可保存 1 个月（1 瓶粉剂即可做 100T，为延长试剂盒使用时间，故此产品多给一支）；

2. 试剂三：临用前加入 0.1mL 丙酮，丙酮易挥发，使用完毕后注意封口，-20℃可保存 2 个月；

3. 试剂三工作液：临用前根据用量将试剂三：丙酮=5μL：0.5mL（约 50T）混合备用，现用现配；

4. 试剂四：临用前取一支加入 1.6mL 蒸馏水（约 100T），充分溶解，-20℃可保存 1 个月，避免反复冻融（1瓶粉剂即可做 100T，为延长试剂盒使用时间，故此产品多给一支）；

5. 工作液的配制：根据用量将丙酮：试剂二：试剂三工作液=250μL：250μL：500μL（约 50T）混合备用，现配现用。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、微量石英比色皿/ 96 孔 UV 板、研钵/匀浆器、细胞超声破碎仪、丙酮（>98%，AR）、冰和蒸馏水。

操作步骤（仅供参考）
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献） 

1. 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1.0 mL 提取液一，用匀浆器或研钵于冰上快速匀浆（约 30 次）。

2. 4℃ 600 g 离心 10min，弃沉淀，留上清。上清再次离心，4 ℃ 11000 g 离心 15min，得到上清液和沉淀。 

3. 上一步结果得到的上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅰ（此步可选做，可以判断线粒体提取效果）。

4. 在沉淀中加入 200μL 提取液一和 200μL 提取液二，超声波破碎（功率 200W，超声 5 秒，间隔 10 秒，重复 15 次），用于复合体Ⅰ酶活性测定，并且用于蛋白含量测定。

二、测定步骤

1. 紫外分光光度计/酶标仪预热30min 以上，调节波长至340nm，分光光度计蒸馏水调零。

2. 试剂一37℃预热15min。 

3. 操作表：在微量石英比色皿/96孔UV板中分别加入

三、复合体Ⅰ活力单位的计算

1. 以微量石英比色皿计算：

（1） 按样本蛋白浓度计算

单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅰ活力（U/mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹ ]÷(V 样×Cpr) ÷T =3215.43×ΔA÷Cpr 

V 反总：反应体系总体积，2×10-4L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm；d：微量石英比色皿光径， 1cm；V 样：加入样本体积，0.01mL；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；10⁹：单位换算系数， 1mol=10⁹ nmol。 

2. 以 96UV 孔板计算：

将上述公式中的 d-1cm 改为 d-0.6cm 进行计算即可。

1. 为保证实验结果的准确性，需先取 1-2 个样做预实验，如果测定的吸光值过高（A1 高于 1.5），可用蒸馏水稀释上清液后再测定。计算结果时注意乘以稀释倍数。若ΔA 大于 0.4，需将样本稀释适当倍数（计算公式中乘以相应稀释倍数）；若ΔA 偏小，则可以通过增加加入的样本体积来提高灵敏度。

2. 样本蛋白浓度需自行测定。由于提取液一中含有一定浓度的蛋白（约 1mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量（约 0.5mg/mL）。

3. 推荐使用样本蛋白浓度计算酶活。另附按样本计算公式和按细胞数量计算公式

4. 附：使用样本重量计算公式：（样本检测数为 100T/48S）

A、上清中复合体 I 活力的计算：

单位的定义：每 g 组织在反应体系中每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

复合体 I 活性（U/g 质量）= [ΔA1×V 反总÷（ε×d）×10⁹

]÷(W÷V 提取×V 样)÷T=3215.43×ΔA1÷W

B、沉淀中复合体 I 活力的计算：

单位的定义：每 g 组织在反应体系中每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

复合体 I 活性（U/g 质量）= [ΔA2×V 反总÷（ε×d）×10⁹

]÷(W÷V 重悬×V 样)÷T=1286.17×ΔA2÷W

ΔA1：上清测定值；ΔA2：沉淀测定值；V 反总：反应体系总体积，2×10^-4L；ε：NADH 摩尔消光系数，

6.22×10³ L/mol/cm；d：微量石英比色皿光径，1cm；V 提取：加入提取液一体积，1mL；V 重悬：沉淀重悬

体积（0.2mL 提取液一+0.2mL 提取液二），0.4mL；V 样：加入样本体积，0.01mL；T：反应时间，1min；W：

样本质量，g；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。

C、样本复合体 I 总活力的计算：

样本复合体 I 总活力即为上清中复合体 I 活力与沉淀中复合体 I 活力之和。

按样本质量计算：复合体 I（U/g 质量）=3215.43×ΔA1÷W+1286.17×ΔA2÷W

D、以96UV孔板计算：

将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm进行计算即可。

5. 附：使用细胞数量计算公式：（样本检测数为 100T/48S）

A、上清中复合体 I 活力的计算：

单位的定义：每 10⁶个细胞在反应体系中每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

复合体 I 活性（U/10⁶ cell）= [ΔA1×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(N÷V 提取×V 样)÷T =3215.43×ΔA1÷N

B、沉淀中复合体 I 活力的计算:

单位的定义：每 10⁶ 个细胞在反应体系中每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

复合体 I 活性（U/10⁶  cell）= [ΔA2×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(N÷V 重悬×V 样)÷T=1286.17×ΔA2÷W

ΔA1：上清测定值；ΔA2：沉淀测定值；V 反总：反应体系总体积，2×10^-4L；ε：NADH 摩尔消光系

数，6.22×10³ L/mol/cm；d：微量石英比色皿光径，1cm；V 提取：加入提取液一体积，1mL；V 重悬取：

沉淀重悬体积（0.2mL 提取液一+0.2mL 提取液二），0.4mL；V 样：加入样本体积，0.01mL；T：反应时

间，1min；N：细胞数量，以 10⁶计；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。

C、样本复合体 I 总活力的计算：

样本复合体 I 总活力即为上清中复合体 I 活力与沉淀中复合体 I 活力之和。

复合体 I 总活性（U/10⁶  cell）=3215.43×ΔA1÷N +1286.17×ΔA2÷N

D、以96UV孔板计算：

将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm进行计算即可。

6.本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床诊断或治疗，食品及化妆品等用途。请勿存放于普通住宅区。

7.为了您的安全和健康，请穿好实验服并佩戴一次性手套和口罩操作。

8.实验结果可由多种因素影响，相关处理只限于产品本身，不涉及其他赔偿。

备注：由于产品信息可能会有优化升级，请以实际收货标签信息为准。